抗體親和力成熟

技術背景：

目前，藥用抗體的研發主要基于雜交瘤細胞或者體外抗體庫。通過抗原設計和抗體篩選，人們初步獲得陽性的hits，再進一步通過一系列生物性質檢測和功能驗證，終得到有藥用潛力的抗體。在實際研發過程中，經過了常規篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細致的改進，包括親和力、免疫原性、半衰期等等，抗體領域這些年來做了很多相關的研究和實踐。其中，抗體親和力成熟是研究的重要方向之一。理論上，抗體親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。雖然實際的研究證明親和力的提高與抗體效價的提高并不總是線性的關系，尤其在實體瘤的治療上（可參考Weinstein的“binding site barrier”假說[1]），但很多情況下，這個線性關系是明顯存在的。另外，發展抗體親和力成熟的技術，不僅有助于抗體藥物的研發和質量改善，同時也有助于人們更好地理解抗體與靶點相互作用的機理，更好地認識靶點的功能。

抗體親和力主要技術包括如下幾項：

1. 模擬體細胞高頻突變的抗體親和力成熟策略

BCR基因重排后的成熟B細胞受到抗原刺激后，會于生發中心發生重鏈和輕鏈V區的高頻率突變（主要是點突變），之后再經過FDC捕獲抗原使表達高親和力BCR的B細胞免于凋亡。這一過程使得后代B細胞的BCR對抗原的平均親和力得到提升。這樣的體細胞高頻突變屬于二次免疫應答，幫助可有效識別抗原的抗體進一步成熟，有助于機體有效抵抗外來抗原的再次入侵。

抗體親和力成熟的策略之一，就是模擬體細胞高頻突變，通過細胞突變和展示抗體蛋白篩選對抗原高親和的抗體。原理如下圖：

1.1 基于B細胞系（人、雞等）高頻突變的篩選策略

Ramos是來源于人Burkitt淋巴瘤的一株細胞系，在培養過程中其重排后的免疫球蛋白V區基因持續發生組成型突變，并表達到膜表面。早在2002年Sarah等人就報道了利用Ramos細胞系篩選出對鏈霉親和素有高親和力的IgM。將鏈霉親和素結合到磁珠上，從一群Ramos細胞中篩出對鏈霉親和素有低親和力的細胞群，之后降低磁珠上的鏈霉親和素的密度以提高篩選的標準，進一步篩出親和力更高的突變。之后又進一步用標記FITC熒光的鏈霉親和素結合流式分選將抗體親和力進一步提高。

隨后，他們對各批次的亞克隆細胞的V區基因做了序列比對，找出了突變位點，分析了抗體與靶點之間的構效關系。

同在這篇文章中，他們還嘗試了使用XRCC2缺失的雞來源的B細胞系（DT40），篩選針對多個抗原的高親和力IgM。該細胞系同樣具有高頻率的V區基因組成型突變，并且比Ramos細胞系增殖時間更短。篩選結果顯示該細胞系也能實現IgM的親和力成熟。

以上兩個例子說明合適的B細胞系可以作為工具細胞，用于抗體的親和力成熟。在具體應用中，可以將特定的抗體模板基因插到細胞的免疫球蛋白基因位點，然后進行細胞培養和高親和力細胞群的篩選。

1.2 基于其他細胞高頻突變的策略研究

基于體細胞高頻突變的抗體親和力成熟的開發，主流方法均是基于B細胞系。B細胞系有其自身的不足，如基因操作比較困難、蛋白的翻譯后修飾特點不能滿足所有外源蛋白的要求等等。于是有實驗室嘗試在非B細胞系統上實現親和篩選，以擴充該技術的細胞系選擇面。

如中科院生物物理所杭海英課題組，向人非小細胞肺癌細胞系H1299中導入激活誘導的胞苷脫氨酶（AID），構建H1299-AID穩轉株，然后進一步導入抗TNF-α的scFv基因并構建穩轉株，得到的穩轉株進行培養和流式分選，獲取高親和力的scFv。

除此之外，還有基于非真核系統的篩選方法，如利用E. Coli的基因增變株來實現抗體基因的高頻突變等等，其原理大同小異。

2. 基于抗體庫的親和力成熟策略

基于抗體庫的抗體親和力成熟與基于抗體庫的抗體篩選并無本質差別，均為體外高親和力抗體篩選，重點仍是兩個方面，即庫的構建和篩選系統的選擇。區別在于，后者所用的庫在構建或合成時無偏向性或只具有針對某抗原的有限的偏向性；而前者所用的庫是基于確定的抗體序列模板所構建的。

2.1 建庫策略

建庫的策略可分為兩個大的類別：一類是構建較大的庫，將抗體CDR區域甚至整個V區做隨機突變；另一類是構建較小的庫，將突變集中于抗體序列上特定的區域。

大庫構建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段隨機突變并保證相鄰兩個突變區域有所重疊，從而使突變覆蓋整個CDR區域；chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對重新洗牌，而DNA shuffling則是將抗體V區的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突變不限于CDR區，也包括FR區域，因為FR區域對于抗體與抗原的結合也可能有所貢獻。這些方法所構建的庫的容量較大，工作量也較大。

相比大庫的構建，小庫構建更有序列針對性。在沒有其他信息的情況下，人們習慣優先選擇對抗體重鏈CDR3區域進行隨機突變，因為重鏈CDR3區域被認為通常對抗原抗體結合起關鍵作用；但若要真正提高親和力優化的效率，還需要更多的信息以幫助人們找出更精確的突變區域。

目前突變區域的選擇主要是基于抗原抗體復合物的結構信息或胚系基因熱點（germline hotspots）的預測。

1）基于抗原抗體復合物的結構信息的突變區域選擇

當抗體抗原復合物的結構被解析之后，我們就可以得知兩者相互作用的位點信息，進而進行更精確的突變和建庫。

MorphoSys AG2016年發的文章介紹了他們提高其自身的抗人GM-CSF抗體MOR103的親和力的工作。他們在知悉該抗體與抗原的結合方式后，對抗體的CDR-H2和CDR-L3分別做隨機突變，并用噬菌體展示的方法篩選到高親和力的序列，之后再把篩到的重鏈與輕鏈配對，得到一個新的“cross-cloned”抗體:

體外GM-CSF和GM-CSFR結合的抑制實驗比較了這4個抗體的效價。另外，他們還分別解析了這4個抗體與GM-CSF結合的復合物的結構并進行比較，探討了構效關系。

2）基于胚系基因熱點（germline hotspots）的突變區域選擇

Germline hotspots是體細胞高頻突變過程中的優先突變區域，幾乎都處于CDR區域內部，經證明對抗體的親和力提高起到關鍵作用，因此體外親和力成熟時可優先考慮抗體的germlinehotspots。

具體的做法是利用數據庫來比對抗體的序列和抗體胚系基因序列，結合序列相似度和RGYW motifs等坐標性的序列預測出germline hotspots，然后在這些熱點位置進行突變，構建小的庫進行篩選。早在2009年，Ira Pastan課題組就發表protocol，以抗CD22的單抗為例，利用germline hotspots預測和噬菌體展示技術提高抗體的親和力[5]。

至于引入突變的方法，較簡單的是易錯PCR，但很難達到好的突變效果。另外一種比較流行的就是在引物上設計突變，即人工合成帶有突變區域的引物庫。具體的設計方法有很多，包括控制突變堿基的數目、控制每個位點各種堿基出現的概率等，以此來滿足對庫的容量和偏向性的需求。

2.2 篩選方法

基于庫的抗體親和力成熟與基于庫的抗體初步篩選涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統。

酵母展示技術

噬菌體展示的優勢在于操作方便，流程相對簡易；

酵母展示的優勢在于與流式分選相結合，檢測和篩選同時進行；

核糖體展示的優勢是系統容量較大，可用于大庫的篩選，另外可以實現庫的體外進化。這些技術各有優劣，根據實際需要選擇使用。

技術介紹：

根據抗體親合力成熟的原理，在體外抗體親和力成熟的過程中，選擇突變區域以及如何引入突變是一個關鍵問題，目前突變策略主要分三類：隨機突變，隨機突變，置換和定向突變。

易錯PCR：

易錯PCR是目前常用的抗體突變技術，可以在抗體基因的全場或部分區域隨機引入突變；在聚合酶對目的基因擴增時；通過調整反應條件以及使用錯錯配率高的聚合酶等，以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，經過PCR反復進行進行隨機誘變，累計突變效應，終獲得目的蛋白的隨機蛋白突變體。

鏈置換：

保留某個特定抗體的輕鏈或重鏈，另一條鏈與一個隨機化的互補鏈進行組合，從中篩選更高活性的突變株。通過固定抗體兩條鏈中的一條鏈，對另一條鏈構建具有足夠多樣性的置換文庫。隨機組合有可能產生合適鏈組合，通過噬菌體抗體庫篩選可獲得高親和力的抗體。

定點突變：

由于天然抗體在親和力成熟過程中，體細胞高頻突變發生區域并非均勻分布，而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR區，在抗體的親和力體外成熟過程中，CDR去是常選用的定點突變區域，這樣既可以獲得足夠的祖列多樣性，又不會破壞蛋白質結構，對CDR進行定點突變時，可以對多個CDR進行平行突變或者逐步進行優化。

DNA改組：

DNA改組技術是對同源的抗體基因，采用脫氧核糖核苷酸酶Ⅰ將其切割成不超過50bp的片段，再隨機組合后進行PCR擴增成完整的抗體基因的技術，包含了抗體片段隨機化切割重組和篩選的過程，一定程度上模擬了天然抗體親和力成熟的過程，并加快了體外定向進化速度。

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參考文獻:

[1]Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: directexperimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research.

[2]Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitrousing hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology.

[3]Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation innon-B cells. Protein Cell.

[4]Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolutionof a neutralizing anti-human GM-CSF antibody.

[5]In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. MethodsMolBiol