親和力成熟

親和力成熟是改善抗體和抗原親和力的過程。異源抗體在人源化的過程中往往伴隨著親和力的下降，體外親合力成熟的過程包含了引入突變和生物淘選的過程。

艾柏森生物擁有豐富的抗體親和力成熟經驗，我們通常以scFV形式進行抗體親和力成熟改造，同時我們也提供單域抗體的親和力成熟服務。通過隨機突變、定位突變等多種突變方式，結合專有人類抗體數據庫、電子建模等技術進行抗體親和力成熟優化。利用整合數據庫中針對特異抗原的篩選技術，艾柏森生物提供的抗體親和力成熟服務可以將scFV抗體的KD提高至10-8-10-9，甚至艾柏森生物曾成功的獲取KD為10-12的scFV抗體。

服務流程

設計親和力成熟方案

目前主要采用以下幾種方式：點突變（定點突變和隨機誘變）、CDR區重組、鏈替換以及DNA重組等手段。艾柏森生物提供基于抗原-抗體相互作用的結構信息開展體外親和力成熟技術，通過計算機輔助分子模擬確定氨基酸被取代的可能性，預測出氨基酸被取代后產生的結構變化以及如何影響其與靶抗原的結合，并通過噬菌體展示或細胞表面展示技術篩選出具有高親和力的抗體。

1. 設計scFV突變文庫

a. 隨機突變法

一般采用易錯PCR法在整個VH和VL區引入隨機突變。艾柏森生物的突變菌株CD-affiTM能大大增加抗體庫基因的多樣性。同時也可以采用鏈替換的方法引入突變。

b. 寡核苷酸定點突變法

當抗體/抗原復合物結構可知或者可以通過計算機技術模擬時采用。

2. 建立噬菌體展示突變庫

2.1將全套scFV基因片段連接至pCANTAB5e載體，隨后電轉化大腸桿菌TG1；同時鑒定ScFv基因庫庫容（及基因的插入率）。

2.2將輔助噬菌體M13K07加入到轉入了ScFv抗體基因的，生長至對數生長期的大腸桿菌中進行噬菌粒拯救。

2.3培養過夜后，離心收集上清即獲得噬菌體ScFv抗體庫，并對抗體庫的滴度進行測定。

3. 噬菌體展示突變抗體庫篩選

采用兩種純抗原篩選方式：固相篩選法和液相篩選法經過4輪的淘洗，一般情況下抗體的親和力可以達到10-8以上。流程示意圖見下圖。

4. ELISA比較噬菌體展示的人源化scFV和親本鼠scFV的親和力

噬菌體擴增— ELISA檢測—噬菌體DNA提取—噬菌體DNA測序

5. 人源化scFV的ELISA驗證

從以上已測序的結合噬菌體中，挑取5-10株不同序列的噬菌體進行抗體的可溶性表達，并進行ELISA鑒定。

6. 測序

對親和力較好的scFV進行基因測序，排除FR區包含大量非人源序列的突變體。

7. 親和力測定

艾柏森生物采用BIAcore system和ForteBio Octet平臺，能高效、準確的測定抗體的親和力。 ForteBio還可以用于過程中定量分析、抗體篩選以及細胞系優化、抗原表位定位、抗體配對等。挑選3-5株克隆，測定抗體和抗原的親和力。

8. 構建人源化IgG抗體

將人源化scFV抗體的VH和VL通過基因工程的手段分別插入帶有人Fc片段基因的哺乳動物細胞表達系統中，表達全長抗體，并進行親和力測定。