單克隆抗體制備需要篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備,因為融合細胞隨培養時間延長,發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加??贵w制備有兩種方法。一是增量培養法,即將雜交瘤細胞在體外培養,在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備,一般應用無血清培養基,以利于單克隆抗體的濃縮和純化。
單克隆抗體制備過程:
1)免疫脾細胞的制備制備單克隆抗體的動物多采用純系Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質。免疫方法同一般血清的制備,也可采用脾內直接免疫法。
2)骨髓瘤細胞的培養與篩選在融合前,骨髓瘤細胞應經過含8-AG的培養基篩選,防止細胞發生突變恢復HGPRT的活性(恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養基中存活)。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養液在細胞培養瓶中培養,融合前24h換液一次,使骨髓瘤細胞處于對數生長期。
3)細胞融合的關鍵:
1.技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如,供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2.融合試驗失敗的原因是污染,融合成功的關鍵是提供一個干凈的環境,以及適宜的無菌操作技術。
4)陽性克隆的篩選應盡早進行。通常在融合后10天作一次檢測,過早容易出現假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據抗原的性質,以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法簡便,RIA法準確。陽性克隆的篩選應進行多次,均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。
5)克隆化克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體??寺』瘧M早進行并反復篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩定的,有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩定的雜交瘤細胞株??寺』姆椒ê芏?,而常用的是有限稀釋法。