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4009658633熱門關鍵詞：抗體類，蛋白類，分子細胞類，化學品與試劑
細胞分選在多種研究領域都有涉及，例如腫瘤學，神經生物學，免疫學等。上次和大家分享了磁珠分選，除了磁珠分選還有流式分選，今天小編在這里跟大家聊一下流式分選的原理、應用及與磁珠分選的區別，希望能幫到大家一二。
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流式細胞儀分選原理
流式細胞儀分選細胞有兩種方法：一是“Catch Tuber"即“捕獲管法"就是機械手臂以極快的速度出入樣品液流，在細胞通過激光照射并被確認之后快速捕獲目標細胞至收集系統中，此種方法常用于小型臺式機。另一種方法是電子偏轉的方式，即將熒光染色確認的細胞標記正或負電荷，通過電磁場偏轉而分離，此種方法常用于大型科研型機器。
電子偏轉示意圖
操作流程
（1）先制備單細胞懸液（可檢測多種樣本的單細胞懸液：外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液、實體組織、培養細胞等）
（2）樣本染色
①核酸標記：通過核酸染料DAPI、PI等與核酸（DNA）結合，核酸含量越高，結合的染料越多，故可以通過核酸染料的多少以及強弱進行細胞周期分選。
②蛋白標記：偶聯熒光素的單克隆抗體與細胞表面/胞內的抗原結合，結合的量越多，熒光信號就越強。
③熒光報告蛋白：很多報告蛋白是熒光蛋白（GFP、DsRed等），可成為流式檢測時熒光信號的來源。
（3）細胞分選
鞘液和樣品流進入噴嘴后，在電磁傳感器產生的高頻振蕩下，形成穩定的液滴，然后將熒光染色確認的細胞標記正或負電荷，通過電偏轉而分離。
（4）分選后細胞可進一步做分子生物學研究，如熒光定量PCR、western blot、細胞培養等。
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影響流式分選的因素
分選中我們一般都關心分選速度、分選純度、分選得率、分選活性。
（1）如何提高分選速度：
振蕩頻率、鞘液壓力、噴嘴大小、上樣速度
-振蕩頻率越高，分選速度越快；
-振蕩頻率越高，鞘液壓力也隨之增加；
-若要形成穩定液滴，最佳振蕩頻率：f=V/（4.5d）；
-鞘液壓力和噴嘴大小一定時，振蕩頻率相對固定。
-上樣速度過快，得率會降低，故最佳上樣速度=1/4*f
（2）如何提高分選純度：
-精確設定液滴延遲時間（Drop Delay）：指細胞通過激光檢測區到液滴分離斷電位置的間隔時間。
-保證液流穩定：鞘液和樣品流進入噴嘴后，在電磁傳感器產生的高頻振蕩下，形成穩定的液滴，即液流的斷點位置維持在一個固定的位置。
-選擇合適的分選模式
-排除樣本粘連
-合理設門（用散點圖）
-合理閾值設定
（3）如何提高分選得率：
- Drop Delay液滴延遲時間要準確，液流穩定
-如果不考慮純度的情況下（不需后續培養），可以選擇Enrich/yield分選模式
（4）如何提高分選活性
-與細胞本身的活性有關
-與儀器潔凈程度有關
-與鞘液壓力、噴嘴大小有關（對于脆弱細胞，盡量采用低壓和大噴嘴，包裹細胞的液滴越大，對細胞的沖擊越?。?/span>
-與上樣管路設計及管壁光滑程度有關
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流式分選和磁珠分選的比較
總結：二者各有優勢，不能相互取代。
磁珠分選的優勢：
-操作簡單、分選速度快、細胞活性好。
流式分選優勢：
-多參數分選，不同熒光強度的分選。
二者相互結合，可用于分選比例較低的細胞群。例如要分選人的造血干細胞CD43+CD38-,可以先用磁珠分選富集CD34+細胞，再結合流式分選出CD34+CD38-造血干細胞。
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流式分選的應用
（1）流式分選在干細胞研究中的應用
2013年6月，上海中科院生化所李勁松組、神經所孫強組與健康所金穎組合作，建立來自食蟹猴孤雌囊胚的單倍體胚胎干細胞系，發表在Nature子刊Cell Research上，文中單倍體分選涉及到流式分選。
（2）流式分析在染色體分析分選中的應用
瑞士的一組研究人員建立起一套符合GMP標準的大規模體外擴增異體反應性NK細胞用于AML治療的實驗流程，采用經GMP認證的BD Influx分選出單一KIR（killer lmmunoglobulin-like Receptor）特異性的NK細胞，
（3）流式分析在熒光蛋白分選中的應用
將CFP基因插入到Abcg2基因得到基因改造小鼠，流式分選Abcg2/GFP+骨髓細胞，并移植入小鼠體內檢測造血能力，發現：Lin-GFP+細胞顯著富集造血干細胞，Lin-GFP-細胞無造血能力。
好了，今天小編給大家詳細的介紹了流式分選的原理、應用及與磁珠分選的區別，希望對大家以后的實驗有用。
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