熱門關鍵詞:抗體類,蛋白類,分子細胞類,化學品與試劑
多克隆抗體的制備
1. 器材:
剪刀(剪兔毛用)一把、彎頭眼科手術鑷子(游離血管用)一把、直頭眼科手術剪(剪血管用)一把,手術刀架,手術刀片,注射器(1ml、10ml,25ml)附針頭,兔子固定架,滅菌三角燒瓶(200ml)或平皿(直徑18cm)、彎頭止血鉗四把,直頭止血鉗兩把,手術縫合線,塑料放血管,紗布等。
2. 試劑:
生理鹽水(或PBS),
弗氏*佐劑(Freund’s complete adjuvant, FCA) Sigma F-5881,
弗氏不*佐劑(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506,
二甲苯,酒精棉,脫脂棉,2% NaN3
3. 兔子的選擇:
兔子的重量應在四斤以上,兩耳光滑,明顯可見耳靜、動脈,健康。
4. Pre-bleeding:
抗原注射以前需要收集一些正常血清,已備檢測抗體時作為陰性對照。待兔子在新環境中穩定,大概需要四天左右時間,可以進行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。
免疫用的抗原必須純化,否則影響抗體的質量??乖汧CA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化,乳化過程比較費時、費力,但若乳化不充分,會影響免疫的效果,振蕩后,1000rpm離心一分鐘,如水相和油相不分層即可注射。第一次免疫用FCA,以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多點注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射,每點注0.1ml,間隔2周后再于上述部位選不同點注射(不要選擇臨近位點,否則潰瘍愈合不好)。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數在四五次即可,抗原用量大可以減少次數。
免疫一周后,可以耳動脈取血檢測抗體效價。因為起初幾次免疫產生的抗體的效價比較低,頭兩次取血,夠檢測用即可。在三次免疫后,可以獲得較高效價的抗體,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否則會造成兔子貧血。最后一次取血可以采用頸動脈放血,具體操作如下:
a.家兔仰臥于兔架上固定頭部,用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚;
b.沿頸部中線用手術刀切開皮膚約10cm,分離皮下結締組織,直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮?,如碰到小血管出血,可用止血鉗止血)
c.用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織,暴露出頸總動脈后用彎頭眼科鑷使之游離,剝離神經和結締組織;
d.于動脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾??;
e.用小拇指墊在血管下,用尖頭眼科手術剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口(勿剪斷),插入塑料放血管。再將近心端的絲線結扎固定于放血管上,以防放血管滑脫;
f.松開止血鉗,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
5. 血清的分離:
如果用三角瓶或平皿盛血,將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr,轉移到4oC沉淀過夜,第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集,37oC烘箱放置2hr,轉移到4oC沉淀過夜,第二天早上離心,10000RCF,10分鐘。在血清中加入 NaN3 至終濃度0.02%,分裝后-20oC保存。