蛋白表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。越來越多的基因被發現，其中多數基因功能不明，利用蛋白表達系統表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。常見的蛋白表達系統包括大腸桿菌/原核蛋白表達系統、酵母/真核蛋白表達系統、哺乳動物細胞蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統、植物蛋白表達系統。
我們如何得到可溶的蛋白？
如果希望得到能行使功能的蛋白，蛋白應該以可溶形式表達。避免包涵體形成的方法很多，比如選用表達量不高的蛋白表達系統，選擇有助于可溶性表達的融合蛋白表達系統等，使用基本培養基等也有助于可溶性表達。另一個容易忽視的問題是大腸桿菌內還原性過高會導致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導致表達產物不溶，更換菌株有助于解決這個問題。
大腸桿菌蛋白表達試驗中需要注意哪些事項？
1.所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質發生變性。
2.根據自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。
3.構建好的載體進行測序驗證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
4.長期保存的pET重組子在高濃度甘油中會導致質粒不穩定。
5.37℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而30℃生長則可能產生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長誘導時間可以使溶解性蛋白的產量達到大。
6.進行SDS-PAGE分析時，需優化電泳上樣體積。
在線客服
電話咨詢
